MicroscopeSpectroscopy

Spektroskopie im sichtbaren Licht

Der Standard Arbeitsbereich für die Spektroskopie im sichtbaren Licht von 350 – 700 nm kann im einfachsten Fall mit Lampen der Mikroskop Anbieter abgedeckt werden. Es sind direkt eingekoppelte 100W Halogenlampen mit dem Vorteil einer hohen Leuchtdichte, so dass neben der üblichen Hellfeldmikroskopie sowohl Spektroskopie im polarisierten Licht als auch Dunkelfeldspektroskopie möglich sind. Speziell die Dunkelfeldspektroskopie erlaubt die Vermessung von Nanopartikeln und Größenverteilungen unter lichtmikroskopischen Bedingungen, was im Gegensatz zur Elektronenmikroskopie eine wesentliche präparative Vereinfachung zur Folge hat.

Nachteilig ist bei diesen Lampen ihre hohe Stromstärke, denn sie kann zu Spannungsschwankungen und damit zu Intensitätsoszillationen führen. Zwar liegen diese „nur“ im Bereich von ca. einem Prozent, doch sie hinterlassen einen deutlichen Effekt in der Qualität der Spektren und erfordern ein Signal Averaging durch unsere SpectraVision Software. Hilfreich ist hier eine PC-gesteuerte hochstabilisierte Spannungsversorgung als Ersatz zur Einbauversion im Mikroskop. Sie sorgt für eine ausreichend stabile Intensität, und reduziert die zeitaufwendige Spektren Mittelung.

Die bessere Alternative ist eine speziell für die Anforderungen der Spektroskopie ausgelegte fasergekoppelte Halogenbeleuchtung. Sie hat bereits ein werkseitig optimiertes hochstabilisiertes Netzteil und kann oft zusammen mit einem Spektrometermodul in einem gemeinsamen Rack betrieben werden.

In neuester Zeit geht der Trend dahin, Halogen- durch LED Beleuchtung zu ersetzen. Generelle Vorteile im Vergleich zu Halogen sind:

• lange Lebensdauer
• hohe Stabilität in der Beleuchtungsstärke
• konstante Farbtemperatur bei unterschiedlichen Helligkeiten
• geringer Stromverbrauch
• Kaltlicht, daher meistens ohne Lüfter (völlig geräuschlos)

Für die Spektroskopie, die eine konstante Lichtemission über das gesamte Spektrum erfordert, bestehen diesbezüglich Grenzen. Denn bei der Weißlicht LED sind bestimmte Wellenlängen nur sehr gering ausgeprägt. Sie weist damit Lücken im Spektrum auf. Um weißes Licht mit einem ausbalancierten Spektrum zu erhalten, können mehrere verschieden farbige LEDs miteinander kombiniert werden. Hierzu existieren Lösungsvorschläge unterschiedlicher Hersteller, die wir in unsere Konzepte einbinden. Die LED Beleuchtung kann am Mikroskop direkt oder Faser gekoppelt angebracht werden.

Erweiterung für Near Infra Red (NIR)

Da Halogenlampen einen großen Anteil ihrer Energie als Near Infrared emittieren, reicht ihre Emission in der Regel für die NIR Spektroskopie völlig aus. Es ist aber darauf zu achten, dass das eingesetzte Mikroskop für den NIR Bereich ausgelegt ist. Denn die meisten Geräte verfügen über integrierte Wärmeschutzfilter und optische Elemente, die den NIR Bereich gezielt unterdrücken. Um das Mikroskop und seine optischen Komponenten durch Hitzestrahlung nicht zu beschädigen, können diese Baugruppen nicht ersatzlos entfernt werden, sondern sind durch die entsprechenden NIR tauglichen Varianten auszutauschen.

A.S. & Co verändert hierzu die handelsüblichen Mikroskope und optimiert sie für den NIR Bereich durch schaltbare Schutzfilter, die den Bereich der geräteschädigenden Bestrahlung nur für den Millisekunden dauernden Messvorgang freigibt.

Erweiterung für Deep UV

Standard Lichtmikroskope werden seit der Einführung der Unendlich Optik mit einen Transmissionsfenster zwischen 310 nm und dem nahen Infrarot (NIR) ausgelegt. Messungen in der Spektroskopie können allerdings Arbeitsbereiche ab 230 nm erfordern. Für die langfristige Beständigkeit der reflexmindernden Beschichtungen der optischen Komponenten ist es dabei notwendig, geeignete Maßnahmen gegen ihr Ausbleichen durch starke UV Bestrahlung einzubauen. Darüber hinaus sind natürlich auch Arbeitsschutzbestimmungen zu berücksichtigen, die für Umgang mit UV Licht vorgeschrieben sind.

A.S. & Co. verändert hierzu die handelsüblichen Mikroskope und optimiert sie für den UV Einsatzbereich mit

• externen Hilfsbeleuchtungen, die ergänzend zum Messlicht als vollwertiger Ersatz bei der Zentrierung von fasergekoppelten Lichtquellen dienen, so dass UV Licht ausschließlich für die kurze Zeit des Messvorgang eingestrahlt wird.
• Faserkollimatoren, die chromatische Längsaberration von UV ausgleichen können
• Austausch von beschichteten Komponenten durch Vollglaselemente. Diese sind zwar technologisch aufwendiger konzipiert, ermöglichen aber reflexmindernde und kontraststeigernde Ergebnisse auch ohne Beschichtungen
• eigenen DUV-NIR Sperrfiltern mit Strichplattenmuster als Augenschutz im Okular

Für den Einsatz in der Deep UV Mikroskopie integriert A.S. & Co. darüber hinaus noch weitere Änderungen:

• Im Mikroskop Grundstativ müssen alle optischen Linsen und Spiegel im Durchlicht durch Elemente mit UV-tauglichen Eigenschaften ersetzt werden, und
• im Fototubus sind die Prismen und die Tubuslinsen dem Anforderungsprofil der DUV-NIR Mikroskopie anzupassen

Diese Umbauten haben deutlichen Einfluss auf die Empfindlichkeit und die Messqualität (siehe Darstellung der Spektren)

Einfluss des Umbaus auf die Strahlführung:

DUV Strahlung und Objektivschädigung

In der Literatur wird festgestellt, dass die Kombination direkt einstrahlender UV Lampen auf DUV tauglichen Objektive schon nach einer geringen Nutzungsdauer zu extremen Transmissionsproblemen führt, obwohl dieselbe Objektivklasse seit Jahrzehnten in der Mikroskop Photometrie mit Monochromatoren problemlos als Standard eingesetzt wurde. Wirft man einen Blick auf das Handling von älteren Systemen, lassen sich diese Probleme zuordnen. Mikroskop Photometer vom Typ MPM oder MPV nutzen für die Einstellung der Probe und die Auswahl des Messflecks ausnahmslos Licht von Halogenlampen oder UV Quellen, bei denen durch den Monochromator vorzugsweise eine Wellenlängenbegrenzung auf das Grünlicht vorgenommen wurde. Das geräteschädigende UV Licht gelangt nur während der Messung in das Mikroskop und bestrahlt die Objektive auch nur beim Erfassen des kurzwelligen Segmentes. Die Erfahrung zeigt, dass dieser Ansatz die Mikroskop Photometer über mehr als 20 Jahre in voll funktionsfähigem Zustand erhalten hat, so dass sie nicht wegen optischer Mängel ersetzt werden mussten.

Im Gegensatz hierzu nutzen moderne Aufbauten das gesamte Spektrum nicht nur während der Messzeit, sondern auch für die Probeneinstellung. Darüber hinaus werden oft bei der Anregungsblende weitere technologische Abstriche gemacht, so dass zu jedem Zeitpunkt immer die volle Lichtleistung in das Mikroskop und damit auch auf seine Optik einstrahlt.

A.S. & Co. spezifische Baugruppen zur Beleuchtung für die DUV Spektroskopie, zur Steigerung der System Empfindlichkeit und zur Reduktion der DUV-NIR Beleuchtungsstärke sind derzeit unübertroffen zur Lösung dieses Problems.

Beleuchtungen für die Deep UV Spektroskopie

Das Emissionsspektrum einer Xenon Beleuchtung (siehe Abbildung unten) stellt bereits über Jahrzehnte die Standardbeleuchtung eines UV Spektrometers dar. Neben den oben dargestellten objektivschädigenden Auswirkungen liegt das Problem in ihrem Spektrum Bereich unter 300 nm, denn im Vergleich zu seinem Maximum im Blauviolett beträgt die Energieausbeute hier nur etwa 5%. Dies führt zur stark verrauschten bis hin zu völlig unbrauchbaren Messergebnissen bei Wellenlängen unterhalb von 280 nm.

Abhilfe schafft hier das Anregungspektrum einer Deuterium Lampe, dessen beste Lichtausbeute bereits ab 220 nm gegeben ist (siehe Abbildung unten). Leider lässt sich diese Lampe nur bis etwa 550 nm einsetzten, weil sie im langewelligen Bereich deutlich lichtschwächer wird. Darüber hinaus weist sie im Rotbereich unerwünschte Intensitätspeaks auf, deren Höhe den Dynamikbereich des Spektrometers wieder deutlich senken würde.

Die Lösung besteht aus einer Deuterium-Halogen Kombinationsbeleuchtung. Hierzu bieten sich zwei Möglichkeiten an

Deuterium Halogen Kombination auf einer gemeinsamen optischen Bank:
In einem gemeinsamen Gehäuse werden je eine Deuterium und eine Halogenlampe mit separaten Versorgungen, aber einer gemeinsamen Optik zusammengeführt. Die unerwünschten Nebenwirkungen der Deuteriumbeleuchtung werden ausgeblendet, und die beiden Spektren können gemeinsam in einem Lichtleiter zusammen geführt werden.

Diese Lampenkombination bietet eine preiswerte kompakte Lösung für die Bereitstellung des gesamten Anregungsspektrums. Sie kann als Kombinationsspektrum über den gemeinsamen Verschluss getriggert werten. Eine Nutzung der Halogenlampe für die Beobachtung der Probe und die Zentrierung des Strahlengangs ist allerdings nur in einem separaten, von der Messung völlig getrennten Arbeitsablauf möglich. Nur so werden Probe und Mikroskop nicht unnötig geschädigt.

Um trotzdem während der Messung zum Beispiel eine Korrektur der Messblende vornehmen zu können, bietet SpectraVision eine Hilfsbeleuchtung an. Diese ist in die Kollimationsoptik der DUV Faserbeleuchtung integriert und simultan zur Anregungsbeleuchtung geschaltet, so dass die geräteschädigende Deep UV Beleuchtung während des Einstell- und Zentrierprozesses ausgeschaltet bleiben kann.

Kenndaten einer Deuterium Halogen Kombibeleuchtung
Deuterium Modul: 25W 230-400 nm 1000h Betriebsdauer	Halogenmodul: 20W 360-2000 nm 1000h Betriebsdauer

Unabhängig voneinander arbeitende Deuterium und Halogen Lampen:
Diese Anordnung bildet die optimale Kombinationslösung. Beide Lampen werden jeweils mit eigenen hochstabilisierten Netzteilen optimal versorgt und lassen sich individuell in den Mess- und Beobachtungsprozess einbinden.

Darüber hinaus wird die Deuterium Lampe durch geeignete Filter erst ab 220 nm für mikroskopische Applikationen freigeschaltet, so dass die eingesetzten Lichtleiter solarisationsresistent betrieben werden können. Der Messaufbau bleibt somit mittelfristig stabiler. Natürlich wird auch der nicht gewünschte langwellige Bereich korrigiert.

Bei der helleren Halogenlampe lässt sich durch den Einbau individuell abgestimmter Graufilter die Intensität auf die Leistung der Deuterium Lampe abstimmen. Dies bewirkt, dass die Kombination der beiden die Dynamik des Anregungsspektrums deutlich verbessert und damit auch die Erkennung kleinster Helligkeitsunterschiede ermöglicht.

Kenndaten der separat zu nutzenden Deuterium und Halogenlampe
CLH Kenndaten: Einschubmodul, 12V, 20W 340-220 0 nm, bei ca. 3200K, 2000 h Lebensdauer Option: elektronischer Verschluss 1 Hz Konvexlinsen zur Fasereinkopplung	CLD Kenndaten: Einschubmodul, 30W 220-620 nm 2000 h Lebensdauer elektronischer Verschluss, 1 Hz Quarz Optik zur Fasereinkopplung

Alle Lampen von A.S. & Co werden über die SpectraVision Basic Software koordiniert Sie bindet die Funktionen des Mikroskops ein und sorgt für

• das vollautomatische Schalten von Lampen und Mikroskop Verschlüssen
• das Einschwenken von Abschwächfiltern, so dass eine Intensitätsänderung zwischen der Messbeleuchtung mit 3200K und einer Beobachtungsbeleuchtung ohne Spannungsänderung an den Lampen vorgenommen werden kann.
• eine automatische Dunkelstromkorrektur

Ausgleich der geringeren Beleuchtungsintensität der Deuterium Halogen Kombination
Im Vergleich zur herkömmlichen Xenon UV Lampe weist die Deuterium Halogen Kombination eine deutlich schwächere Beleuchtungsintensität auf. Um die beschriebenen Vorteile dieser Kombination dennoch nutzen zu können, gewinnt die Steigerung der System Empfindlichkeit zusammen mit der Reduktion der DUV-NIR Beleuchtungsstärke durch A.S. & Co. eine besondere Bedeutung.

Steigerung der System Empfindlichkeit

Optimierung der Strahlführung
Spezifische, von A.S. & Co. entwickelte Baugruppen zur Optimierung der Strahlführung bewirken einer deutlichen Verbesserung der System Empfindlichkeit im Vergleich zu Standard Mikroskopen, die als Basis der konventionellen sich im Markt befindlichen Systemen zum Einsatz kommen:

• Monofaser-gekoppelte Spektrometer bieten eine ca. 30% höhere Signaltransmission vom Mikroskop zum Sensor im Vergleich zur herkömmlichen y-Faser.
• eine integrierte Lichtquelle innerhalb des Faserkollimators ermöglicht die direkte Beleuchtung der Messblende und vermeidet den Lichtverlust durch Strahlteilungen im Mikroskop.
• modifizierter Spektro Phototubus: Der Standard Phototubus wurde auf einen höheren Lichtdurchsatz optimiert. Da sich alle Optimierungen potenzieren, macht sich der verbesserte Lichtdurchsatz am Tubus in der Gesamtperformance und Reproduzierbarkeit positiv bemerkbar. Zusammen mit dem A.S. & Co. Produkt „Live Overlay Modul“ werden die Beleuchtungs- und Messblenden direkt in das Okular abgebildet. Der Betrachter sieht das Probenbild sowie die Blenden, deren Position, Größe und Schärfe gleichzeitig live.

Auswahl von hoch empfindlichen Sensoren
Ein weiteres Hilfsmittel ist die Verwendung eines hoch empfindlichen Sensors, der die Hellfeld DUV Transmission fördert. Er verkürzt die Messzeiten und schützt damit sowohl Gerät als auch Probe. DUV Systeme von A.S. & Co. werden in der Regel auf der Basis von Peltier gekühlten CCD Arrays mit 1024 x 65 Pixeln und einer Auflösung von 0,8 nm/Pixel konfiguriert. Mehrere Parameter erhöhen die Empfindlichkeit:

• Wichtigstes Kriterium ist die Pixelgröße. Je größer die Messfläche, desto besser die Empfindlichkeit. Im Vergleich zu einer üblichen Photo Kamera mit Pixelgröße von 2 – 6 μm bieten die Spektrometer von A.S. & Co. mit 24 x 24 μm eine 15-mal größere Pixelfläche.
• Die Arrays haben in der Vertikalen 64 Pixelzeilen. Vertikales Binning über 50 Pixel vergrößert die aktive Detektionsfläche auf mehr als 28.000 μm pro 0,8 nm Auflösung. Diese große Gesamtdetektionsfläche bewirkt eine ausgezeichnete Empfindlichkeit und prädestiniert den Sensor zum idealen Messinstrument auch für kritische Fluoreszenz Untersuchungen.
• Die Kühlung verbessert die Rauschunterdrückung. Dies führt zu klar ausgeprägten Kurven, die ohne mathematische Glättung und Mittelung zur Interpretation herangezogen werden können.
• Darüber hinaus sorgt die Kühlung für ein konstantes Signal/Rausch Verhältnis während der Datenaufzeichnung, denn der Sensor bleibt stets auf einer konstanten Temperatur. Er ist damit unabhängig von den Laborbedingungen. Dies ist von besonderer Bedeutung, da Messungen aus den verschiedensten Klimazonen auf Grund der weltweit geltenden Normierung oftmals direkt miteinander verglichen werden.

Reduktion der DUV-NIR Beleuchtungsstärke

Spezifische Baugruppen von A.S. & Co. bieten Möglichkeiten, mit denen die Lichtintensität und damit die Menge der schädigenden Beleuchtung grundsätzlich reduziert werden kann.

Einsatz von DUV Leuchtfeldblenden
Blenden auf der Anregungsseite können diese Aufgabe übernehmen, denn die hier vorgestellte Form der Mikroskop Spektroskopie nutzt in der Regel nur ein kleines eng begrenztes, rechteckiges oder kreisförmiges Messfeld. Es liegt daher auf der Hand, die nicht benötigte Fläche durch entsprechende Blenden auszugrenzen. Dies führt neben einer deutlichen Kontraststeigerung durch die Abnahme der Überstrahlung auch zu einer erheblichen Senkung der UV Belastung.

Berücksichtigung des Beleuchtungsprinzips von August Köhler
Kombiniert man die genannte DUV Leuchtfeldblende zusätzlich mit einem Deep-UV tauglichen Kondensor-Konzept, entsteht eine UV Beleuchtung mit bestmöglicher Konzentration der Energie auf die zu vermessende Fläche. Der Effizienzgewinn ergibt zusammen mit dem Austausch des klassischen Beleuchtungsstrahlengangs durch UV-taugliche Baugruppen eine weitere Senkung der Einstrahlintensität. Auch die durch Beugungsfiguren an den Blendenlamellen nicht vermeidbaren Farbsäume treten in den Hintergrund und fallen verglichen mit dem Messsignal nicht mehr ins Gewicht.

Unser inhouse-entwickelter Köhler Kondensor mit Hochpräzisions-Feintrieb wurde dahingehend konzipiert, eine extrem kleine Messblende unter hoher Vergrößerung auszurichten.

Das Arbeiten mit solch kleinen Messblenden bietet Vorteile:

• Minimierung unerwünschter Lichtenergie, die Linsen und Beschichtungen im Mikroskop zerstört
• präzise Eingrenzung des Anregungslichts auf die Probe
• volle Exposition mit der bestmöglichen numerischen Apertur
• Beschränkung der Expositionszeit auf den Millisekunden-Bereich
• Vermeidung von Beschädigungen der Probe durch Hitze oder hochenergetisches Licht
• Kostenersparnis für Reparatur und Austausch von optischen Teilen und Linsen

XBO-Lösungen für die Mikroskopie

Das Arbeiten mit Xenon Hochdrucklampen ist neben der Halogenbeleuchtung eine der ältesten Lichtquellen für die Mikroskop Spektroskopie. Ähnlich wie bei den Halogenbeleuchtungen kann man einen Großteil der Aufgaben mit den Lampen der Mikroskop Hersteller lösen. Die Erfahrung in der Praxis über Jahrzehnte hat gezeigt, dass im Leistungsvergleich der 75W XBO Brenner die effektivste Abstrahl-Charakteristik aufweist, so dass mit dieser Lichtquelle die besten Ergebnisse erzielt werden. Qualitätsbestimmend für die Emissionseigenschaften und die Lebensdauer sind hierbei die Stabilität des Lichtbogens und seiner Spannungsversorgung sowie die Auswahl des Glasfensters. Das beigefügte typische Lampenspektrum zeichnet sich durch eine hohe Intensität bei extrem kurzen Messzeiten aus.

Gleichzeitig ist die recht schwache Lichtausbeute im Deep UV anzusprechen. Es lässt sich feststellen, dass XBO Lampen ihre Berechtigung dann haben, wenn durch die Kombination mit Anregungsmonochromatoren eine hochspezifische, extrem wellenlängengenaue, aber licht selektierende Beleuchtungsanordnung bereit gestellt werden muss, die eine hohe Einstrahlenergie als Voraussetzung erfordert.

Monochromatoren in Verbindung mit Xenon Beleuchtungen

Hierzu gibt es von unterschiedlichsten Anbietern Kompaktlösungen die entweder das schnelle Galvanometerprinzip nutzen oder die wesentlich präziseren Steppermotor-Antriebe für die Positionierung der Monochromator Gitter einsetzen. Auch stehen zunehmend mehr Varianten mit Akusto Optischen Tunable Filtern (AOTFs) zur Verfügung. Diese fahren einen, wenn auch deutlich eingeschränkteren Wellenlängenbereich in infinitesimal kurzen Schaltzeiten ab. Den Systemen ist gemeinsam, dass sie, in Kombination mit Kameras zur Messung von Fluoreszenzen oder in der Kombination mit Spektrometern und Photomultipliern, Densitometrie und Farbmetrik im höchstauflösenden Bereich erlauben.

A.S. & Co hat unterschiedliche Modelle in SpectraVision integriert und mit Software zur zweidimensionalen Auswertung und zum Spektren Mapping kombiniert. Hierzu stellen wir auf Anfrage gern unsere Konzepte detailliert vor.

Modulare Doppelmonochromatoren mit Xenon Beleuchtungen

Im Allgemeinen bevorzugen wir jedoch einen modularen Aufbau, bestehend aus einer externen XBO Beleuchtung in Kombination mit einem separaten Doppelmonochromator. Diese monochromatische Beleuchtungseinheit wird über einen Lichtleiter entweder als Vollbildausleuchtung für die Videotechnik oder als Spotbeleuchtung zur Spektroskopie eingekoppelt. Der Vorteil dieses modularen Aufbaus liegt in der individuellen Gestaltung der einzelnen Komponenten. So kann bspw. durch den Einsatz eines asphärischen Quarzkollektors die maximale mögliche Intensität der XBO auf den Eingangsspalt des Doppelmonochromators abgebildet werden.

Die Optimierung des ersten Gitters erfolgt

• auf den Wellenlängen-Scan-Bereich,
• auf die Bestimmung der wirkungsoptimierten Wellenlänge,
• auf die Lage der gewünschten Dispersionseffektivität,
• auf die erforderliche Auflösung mit der resultierenden Energiebilanz.

Die selektierte Wellenläge wird auf einen zweiten Spalt abgebildet, mit dessen Größe die Halbwertsbreite festgelegt wird. Dabei werden durch die Duplizierung des Aufbaus die Nebenmaxima und das Streulicht höchst effektiv ausgeschaltet. Ein Lichtleiter mit Faserquerschittswandler und zentrierbarer Kollimationsoptik projiziert die Energie am Austrittsspalt in die Probenebene des Mikroskops.

Zur Streulichtabschirmung werden noch zusätzlich Kurzpass- bzw. Langpass- oder auch Interferenzfilter über ein motorisiertes Filterrad in den Strahlengang eingeschwenkt, und zum Schutz der Gitter gegen unnötige UV Strahlung befindet sich ein Magnetverschluss hinter dem Eingangsspalt.

A.S. & Co. fertigt diese Aufbauten individuell nach den Applikationsvorgaben der Kunden, aber exemplarisch wird hier als Beispiel die Strahlführung eines Standardaufbaus gezeigt.

Kenndaten eines Standard Monochromators

• Wellenlängenbereich: 200-800 nm
• Apertur Ratio: F/3,5
• Auflösung bei 2 mm Eingangsspalt: 1,5-14 nm
• Streulicht : 10exp-7 bei einem Abstand von 20 nm und Lambda=632,8
• Wellenlängen Reproduzierbarkeit: 0,5 nm

Xenon Beleuchtung als Blitzmodul

Für Applikationen im Life Science Bereich, aber auch bei Anwendungen im Machine Vision Bereich werden oft Pulslichtquellen verwendet. A.S. & Co bietet deshalb auch Blitzmodule auf der Basis von Xenon Röhren an. Sie sind modular aufgebaut, werden in eigene Gehäuse mit den entsprechenden Spannungsversorgungen eingesetzt und über Fasereinkopplungen mit dem Mikroskop verbunden. Ähnlich wie bei den Monochromator Systemen gibt es auch hier die Möglichkeit zur Vollbildausleuchtung und zur Spotbeleuchtung. Die Positionierung der Beleuchtung erfolgt durch unsere zentrierbaren Kollimatoren, wobei eine kontinuierliche Hilfsbeleuchtung, die entweder in den Kollimator integriert ist oder über einen y-Lichtleiter hinzu geschaltet werden kann, diesen Positioniervorgang erleichtert.