MicroscopeSpectroscopy

Kalibrierung von UV-VIS-NIR Spektrometern

Für die Kalibrierung und Requalifizierung von UV-VIS-NIR Mikroskop-Spektrometern auf Wellenlängen-Genauigkeit und photometrische Richtigkeit hat A.S. & Co. Kalibrierhilfen sowie ein Software QC-Modul entwickelt, das den Prozess der Geräteprüfung abhängig vom eingesetzten Lichtmikroskop Typ entweder manuell oder voll automatisiert durchführen kann. Zwei voneinander unabhängige Messungen zur Erfassung der Wellenlängengenauigkeit und photometrischen Genauigkeit (Abschätzung des Dynamikbereichs) definieren die Qualität der Ergebnisse.

Die QC-Module bestehen aus Vollglasfiltersätzen in speziellem A.S. & Co.-Design, die eine Positionierung im parallelen Strahlengang erlauben. Ein Holmiumoxid Glasfilter dient der Überprüfung der photometrischen Richtigkeit. Da keinerlei Beschichtungen zum Einsatz kommen, sind diese Filter extrem langzeitstabil und resistent gegen zerstörende Strahlung. Ihre Ausgangscharakteristik wird in einem Zertifikat vom Deutschen Kalibrierdienst bestätigt.

Die Filter lassen sich in Filterschiebern, einem Filterrad oder motorisierten Filterwechsler integrieren. Bevorzugt kommen Zeiss Mikroskope vom Typ Axio Imager oder Axio Scope zum Einsatz, aber auch die Integration älterer Geräte wie das MPM oder UMSP sind problemlos möglich. Aus der Palette der Leica DM Stative gibt es Anpassungen für die Gruppe der 2000er, 4000er und 6000er Serien und die Photometer MPV 2 und MPV 3, von Nikon werden in der Regel die Eclipse Mikroskope genutzt.

Erfassung der photometrischen Genauigkeit

Zur Funktionsprüfung der Photomultiplier und CCD Mikroskop-Spektrometer auf photometrische Genauigkeit sowie zur Bewertung des nutzbaren Dynamikbereichs verwendet A.S. & Co. Neutralglas- Graufilter konstanter Filterstärke mit Dichten von 0,0–3,0 OD (optional höher). Damit lassen sich die Kalibrierkurven hinterlegen und bei Bedarf abrufen. Die Ist-Kurve wird gegen die Soll-Kurve aufgetragen und hat im Idealfall einen linearen Verlauf, mit beginnender Nichtlinearität bei sehr hohen optischen Dichten. Gleichzeitig zeigt sich die maximal sinnvolle optische Dichte, bis zu der eine ausreichend genaue Differenzierung noch auswertbar ist.

Die Ergebnisdarstellung erfolgt automatisch für die fünf vom Deutschen Kalibrierdienst vorgegebenen Wellenlängen. Das Auswerteprotokoll des QC-Moduls ermöglicht dem Anwender, die Messbereitschaft des Arbeitsplatzes nachzuweisen und frühzeitig Veränderungen am System zu erkennen oder ob Handlungsbedarf für eine Geräteüberprüfung vorliegt.

Der Vorteil für den Nutzer besteht darin, dass er den Anforderungen an sein Qualitätsmanagement gerecht wird und seine Proben mit der bestmöglichen Performance bearbeiten kann. Beispielsweise bedeutet dies für den kriminaltechnischen Anwender, dass er abschätzen kann, ob es noch möglich ist, in forensischen Vergleichsmessungen tiefschwarze Fasern zu differenzieren. Der Life Science Nutzer, Industrieanwender oder Geologe erkennt dagegen direkt, ob er lichtschwache Proben und eine kritische Helligkeit wie beispielsweise eine Fluoreszenzcharakteristik oder ein Dunkelfeldsignal noch so ausreichend differenziert dargestellt bekommt, dass dieses sich für eine graustufenbasierte quantitative Analyse eignet.

Erfassung der Wellenlängengenauigkeit

Holmiumoxidfilter als Wellenlängen Referenz

Zur Bestimmung der Wellenlängengenauigkeit verwendet A.S. & Co. Holmiumoxid Glasfilter. Das Spektrum von Holmiumoxid verfügt über schmale, definierte Peaks bei mehreren Wellenlängen im gesamten Arbeitsbereich. Sie können für die Prüfung der Wellenlängengenauigkeit und die Qualitätsbewertung des UV-VIS-NIR Arbeitsplatzes herangezogen werden. Die Positionen der Holmium-Peaks variieren geringfügig in Abhängigkeit von den Produktionschargen (Verschiebung bedingt durch die Glasmatrix). Aus diesem Grund wird jeder Holmiumoxid Glasfilter individuell kalibriert und mit eigenem Zertifikat des Deutschen Kalibrierdienstes geliefert.

Mit dem SpectraVision QC-Modul von A.S. & Co. kann der Anwender die Überprüfung seines Arbeitsplatzes in selbst definierten Abständen durchführen oder automatisiert direkt bei Systemstart, um so die Messbereitschaft seines Mikroskop-Spektrometers nachzuweisen. Die Software führt ihn durch den Messablauf und schließt die Messung mit Auswertung und Protokoll ab.

Die QC-Prüfungen der Mikroskop-Spektrometer Arbeitsplätze können auch als Dienstleistung per Fernwartung erfolgen und werden im Rahmen unserer A.S. & Co. Serviceverträge als Bestandteil eines Gerätechecks serienmäßig durchgeführt.

Gasentladungslampen als Hilfsmittel zur Wellenlängenbestimmung

Zur Abschätzung der Wellenlängen Genauigkeit können die Spektren von Gasentladungslampen gemessen werden, denn sie weisen einige auf das zehntel Nanometer exakt definierte Peaks über den Messbereich verteilt auf. Bedingt durch eine sich kaum ändernde Gaszusammensetzung emittieren sie auch mittelfristig konstant ihr bekanntes Emissionsspektrum und können dazu dienen, die spektralen Eigenschaften der Monochromator/Array Kombination konstant zu referenzieren.

A.S. & Co bietet ausgewählte Kalibrierungslampen an mit Wellenlängen zwischen 190 und 900 nm. Als wichtigste kurzwellige Lampe ist hier der HBO Quarzstrahler hervorzuheben mit den Wellenlängen 184,9 nm; 253,6 nm; 312,5 nm; 365,0 nm; 404,7 nm; und 435,8 nm.

Für den langwelligen Bereich empfehlen wir einen Krypton Strahler mit definierten Peaks bei 427,4 nm; 450,2 nm; 556,2 nm; 587,1 nm; 599,3 nm; 645,6 nm; 758,7 nm; 768,5 nm; 785,5 nm und 806,0nm.

Beide Lampen werden mit stabilisierten Spannungs-Versorgungen in speziell vorgefertigten Halterungen ausgeliefert, die eine Direkteinkopplung in das Mikroskop erlauben. Für den Fall, dass sämtliche Ports des Mikroskops bereits belegt sind, besteht darüber hinaus die Möglichkeit der Strahl Einkopplung mit Hilfe eines schaltbaren Umlenkspiegels.

Reflexionsstandards zur Auflicht Mikroskopie

Für das Arbeiten im Auflicht gelten dieselben Rahmenbedingungen. Hier werden entweder Kalibrierstandards mit definiertem Reflexionsverhalten oder Silizium Wafer als Referenzmaterial verwendet. Die nachfolgenden Diagramme zeigen typische Kalibrierstandards für die Mazeralanalyse sowie deren Reflexionsverhalten bei 546 nm.

System-integrierte Fluoreszenzkalibration

Fluoreszenzkalibrierung gegen eine Halogen Lampe

Den gängigen Materialien ist es gemeinsam, dass sich Ihre Eigenschaften mit der Bestrahlung verändern, so dass sie als Kalibrierstandards nur bedingt genutzt werden können. Zur quantitativen Fluoreszenzkalibrierung verwendet A.S. & Co. daher eine Methode basierend auf Ottenjann et al.1, bei der die Fluoreszenz Intensität gegen das Spektrum der Halogenlampe verglichen wird. Das Halogenspektrum kann über das Plancksche Wirkungsquantum geräte-unabhängig definiert werden und liefert damit einen stabilen und sicheren Langzeit-Fluoreszenz-Standard.

Auf Basis der Halogen-Referenz werden die farbmetrischen Kenndaten des Mikroskops erhoben und mit der Farbempfindlichkeit des einzelnen Sensors verglichen. Die sich ergebende Abweichung wird zusammen mit verschiedenen Geräteparametern in die Daten übernommen, so dass man ein system-unabhängiges Fluoreszenzsignal erhält. Der Referenzierungsprozess wird über unsere SpectraVision Software gesteuert, die den Anwender schrittweise durch den Ablauf führt. In Kombination mit einem motorisierten Mikroskop läuft der gesamte Prozess mit einem Klick automatisch ab.

Die Kalibriermethode ist als integraler Bestandteil des Arbeitsplatzes verfügbar und bietet damit wesentliche Vorteile:

• einfache Handhabung
• kein Arbeiten mit unhandlichen Geräten
• sogar labor-übergreifende Vergleiche sind möglich, da keine Anwender bedingten 
Unterschiede auftreten